问题一：如何保证细胞传代后活力不下降？答案在于“温和操作”与“精准时机”。当细胞融合度达到80%—90%时，先用37℃预热的PBS轻轻冲洗两次，再添加0.25%胰酶，在显微镜下观察细胞变圆、间隙增大时立即终止消化——这个过程通常不超过2分钟。记住，宁可多等30秒，也不要提前刮擦瓶壁。
问题二：支原体污染如何预防？核心在于“隔离”与“监测”。首先，建立专用培养基和试剂分区，不同细胞系使用独立储液瓶。其次，每周用PCR试剂盒检测一次培养上清，发现阳性样品立即高压灭菌处理。建议在培养箱内放置含过氧化氢的消毒盘，每月更换一次活性炭滤网。
问题三：冻存复苏后细胞存活率低怎么办？关键在“慢冻快融”。冻存时使用含10%DMSO的完全培养基，以1℃/分钟速率降温至-80℃过夜，次日移入液氮。复苏时务必在40℃水浴中快速摇动，待只剩米粒大小冰晶时加入预温培养基，离心去除DMSO后接种。注意，冻存管标签必须防水，建议使用耐液氮的冻存盒。
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